2. 미카엘리스·멘텐식과 반응 속도 논량의 결정(Km값과 Vmax)
미카엘리스 멘텐의 식이란 효소 반응의 첫 속도를 나타내는 것입니다. 효소 반응의 반응 기구를 조사하는 것은 효소가 수행하는 역할을 고려할 때 중요한 과제가 되고 있습니다. 이를 위해 화학 반응속도론을 이용하는 것은 효과적인 접근법 중 하나라고 할 수 있습니다. 미카엘리스 멘텐의 식을 구하기 위해서는 두 가지를 가정한 상태여야 합니다.
- 제1단계 반응은 평형상태에 있다고 합니다.
- 반응 개시 직후의 극초기(수 ms)를 제외하면 기질 농도는 효소보다 충분히 높다고 생각되며, 모든 효소가 ES 형태라고 합니다. 즉, [ES]의 순의 생성 속도는 제로입니다. 이 상태를 정상 상태라고 부릅니다.
미카엘리스 멘텐의 식을 이용하면 반응속도논량(Km값과 Vmax)을 결정할 수 있는데, 그 전 단계로 효소 반응속도를 구하는 방법을 알아둘 필요가 있습니다.
1) 반응속도 논량의 결정 (Km값과 Vmax)
가) 미카엘리스 멘텐식
미카엘리스 멘텐식이란 효소의 반응속도 v를 속도론적인 거동으로 나타낸 것으로 다음 식으로 표현됩니다.
* [S]: 기질 농도
* Vmax: 최대 반응 속도(기질 농도가 무한대일 때의 반응 속도)
* Km: v=Vmax/2 (최대 반응 속도의 절반 속도)일 때의 기질 농도[S]
Km은 미카엘리스 상수라고 불리며 Km값을 바탕으로 효소와 기질의 친화성을 알 수 있습니다. 즉, Km 값이 작으면 효소와 기질의 친화성이 높다는 의미입니다.
* Km값(최대 반응속도 Vmax의 절반 속도일 때의 기질 농도[S]가 작다는 것은, 보다 적은 기질 농도[S]에서 최대 반응속도 Vmax의 절반 속도에 이른다는 것입니다.
이와 같이 기질 농도[S]를 변화시키면 효소반응 속도도 변화하므로 다양한 기질 농도[S]에서의 초기반응속도 v0를 구함으로써 미카엘리스 멘텐식으로 표현되는 곡선을 얻을 수 있습니다.
미카엘리스-멘텐식으로 표현되는 곡선은 미카엘리스-멘텐식에 의해 이끌어지는 근사곡선입니다만, 이대로는 Vmax값과 Km값을 구할 수 없습니다. 따라서 미카엘리스-멘텐식을 변형하여 플롯을 직선으로 근사할 수 있도록 해야 합니다.
나) 미카엘리스, 멘텐식의 변형
미카엘리스-멘텐식을 변형한 방정식에는, Lineweaver-Burk 플롯, Eadie-Hofstee 플롯 및 Hanes-Woolf 플롯의 3개의 플롯 방법이 있습니다. 먼저 가장 많이 사용되는 변환법인 Lineweaver-Burk 플롯에 대해서 살펴보겠습니다.
① Lineweaver-Burk 플롯
미카엘리스 멘텐식의 역수를 취하여 정리하면, 이것을 Lineweaver-Burk 플롯(라인 위버·버크 플롯)이라고 부릅니다. Lineweaver-Burk 플롯에서는 가로축(x축)에 1/[S], 세로축(y축)에 1/v를 취하고 있기 때문에, 이중 역수 플롯이라고도 불립니다. 효소반응 측정 결과를 바탕으로 Lineweaver-Burk 플롯 그래프를 작성하면 Km값과 Vmax를 구할 수 있습니다.
② Eadie-Hofstee 플롯
미카엘리스 멘텐식의 역수를 따서 Vmax를 걸어 정리하면, 이것을 Eadie-Hofstee플롯(이디·호프스테이플롯)이라고 부릅니다. Eadie-Hofstee 플롯에서는 가로축(x축)에 v/[S], 세로축(y축)에 v를 취합니다.
③ Hanes-Woolf플롯
미카엘리스 멘텐식의 역수를 따서 [S]를 곱하여 정리하면, 이것을 Hanes-Woolf 플롯(헤인즈·울프 플롯)이라고 부릅니다. Hanes-Woolf 플롯에서는 가로축(x축)에 [S], 세로축(y축)에 [S]/v를 취합니다.
다) kcat (턴 오버 수) 결정
Vmax 상태는 대과잉의 기질이 존재할 때의 반응으로 효소-기질 복합체(ES복합체)를 형성하지 않은 효소(E)가 없는 상태이므로 Vmax 값을 효소의 초농도[E]0로 나눈 다음 식에 따라 단위 시간당 1개의 효소가 실시하는 효소반응 횟수를 나타낸 kcat(턴오버 수)를 구할 수 있습니다.
* kcat은 분자활성이라고도 합니다.